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En las ultimas décadas se ido presentando una erosión genética en las especies vegetales debido a la introducción de nuevas tecnologías encaminadas en la producción de cultivares de mejor rendimiento. Estos factores han hecho que se despierte un interés por conservar el germoplasma vegetal.
La crioconservación se presenta como un método económico y relativamente sencillo con el cual se puede conservar el germoplasma vegetal a largo plazo. Este método se basa en el almacenaje del material a bajas temperaturas (-196ºC) en la cual se suspenden casi todos los procesos metabólicos de la planta. Existen numerosas técnicas para hacer crioconservación debido a la heterogeneidad del material vegetal. Sin embargo la técnica se puede generalizar en los siguientes pasos:
Pretratamiento: el grado de tolerancia de tolerancia de las plantas depende en gran parte de su fenotipo y del hábitat en el que se desarrolla. La viabilidad de un material vegetal puede aumentar si se crioconserva en ciertos estados como: estado globular en los embriones somáticos, fase exponencial de las suspensiones celulares y meristemos luego de su extracción.
Crioprotección: para proteger el material vegetal de los daños del descongelamiento y del congelamiento se utilizan sustancias crioprotectoras, el tipo y la concentración de estas sustancias crioprotectoras debe determinarse para cada material vegetal dada su citotoxicidad en concentraciones altas.
Congelamiento: el éxito de la crioconservación de material vegetal depende en gran medida de la acertada elección del procedimiento de congelación que se utilice. Este puede ser:
1. rápido: en el que la muestra se introduce directamente en nitrógeno líquido aunque se corre el riesgo de que se formen cristales de hielo dentro de la célula; este riesgo se disminuye utilizando el crioprotector y disminuyendo la temperatura tan rápido como sea posible se utiliza con volúmenes pequeños de material vegetal y que tengan una baja concentración de agua.
2. lento: el material vegetal se congela de modo gradual permitiendo la deshidratación de la célula hasta llegar a -40ºC en ese momento se disminuye la temperatura rápidamente para evitar una deshidratación excesiva de las células.
3. escalonado: El material se somete a varias temperaturas sucesivamente por debajo de 0ºC y se deja determinado tiempo; posteriormente se sumerge en nitrógeno líquido.
Almacenaje: es preferible que el material se almacene a -196 ºC en nitrógeno líquido lo que posibilita el cese de casi todas las actividades metabólicas. También se puede hacer en congeladores a -100 ºC pero no es recomendable en crioconservación a largo plazo.
Descongelamiento: este se hace al baño de María a 40ºC por uno a dos minutos teniendo precaución de agregar medio de cultivo gradualmente para diluir el crioprotector y evitar la deplasmolisis celular.
Prueba de viabilidad: generalmente se hace recultivando para evaluar la capacidad de regeneración pero también se puede hacer prueba colorimétrica con diacetato fluoresceina; esta técnica se basa en que sólo las células vivas adquieren coloración y emiten fluorescencia cuando se iluminan con luz ultravioleta.
Recultivo: una vez recuperado el material vegetal debe ser recultivado; para ello se utilizan, en general los mismos medios y condiciones en que crecía antes de su congelamiento.
Autor, Gomez J, Murcia C.
correo: [email protected]
CRIOCONSERVACION
En las ultimas décadas se ido presentando una erosión genética en las especies vegetales debido a la introducción de nuevas tecnologías encaminadas en la producción de cultivares de mejor rendimiento. Estos factores han hecho que se despierte un interés por conservar el germoplasma vegetal.
La crioconservación se presenta como un método económico y relativamente sencillo con el cual se puede conservar el germoplasma vegetal a largo plazo. Este método se basa en el almacenaje del material a bajas temperaturas (-196ºC) en la cual se suspenden casi todos los procesos metabólicos de la planta. Existen numerosas técnicas para hacer crioconservación debido a la heterogeneidad del material vegetal. Sin embargo la técnica se puede generalizar en los siguientes pasos:
Pretratamiento: el grado de tolerancia de tolerancia de las plantas depende en gran parte de su fenotipo y del hábitat en el que se desarrolla. La viabilidad de un material vegetal puede aumentar si se crioconserva en ciertos estados como: estado globular en los embriones somáticos, fase exponencial de las suspensiones celulares y meristemos luego de su extracción.
Crioprotección: para proteger el material vegetal de los daños del descongelamiento y del congelamiento se utilizan sustancias crioprotectoras, el tipo y la concentración de estas sustancias crioprotectoras debe determinarse para cada material vegetal dada su citotoxicidad en concentraciones altas.
Congelamiento: el éxito de la crioconservación de material vegetal depende en gran medida de la acertada elección del procedimiento de congelación que se utilice. Este puede ser:
1. rápido: en el que la muestra se introduce directamente en nitrógeno líquido aunque se corre el riesgo de que se formen cristales de hielo dentro de la célula; este riesgo se disminuye utilizando el crioprotector y disminuyendo la temperatura tan rápido como sea posible se utiliza con volúmenes pequeños de material vegetal y que tengan una baja concentración de agua.
2. lento: el material vegetal se congela de modo gradual permitiendo la deshidratación de la célula hasta llegar a -40ºC en ese momento se disminuye la temperatura rápidamente para evitar una deshidratación excesiva de las células.
3. escalonado: El material se somete a varias temperaturas sucesivamente por debajo de 0ºC y se deja determinado tiempo; posteriormente se sumerge en nitrógeno líquido.
Almacenaje: es preferible que el material se almacene a -196 ºC en nitrógeno líquido lo que posibilita el cese de casi todas las actividades metabólicas. También se puede hacer en congeladores a -100 ºC pero no es recomendable en crioconservación a largo plazo.
Descongelamiento: este se hace al baño de María a 40ºC por uno a dos minutos teniendo precaución de agregar medio de cultivo gradualmente para diluir el crioprotector y evitar la deplasmolisis celular.
Prueba de viabilidad: generalmente se hace recultivando para evaluar la capacidad de regeneración pero también se puede hacer prueba colorimétrica con diacetato fluoresceina; esta técnica se basa en que sólo las células vivas adquieren coloración y emiten fluorescencia cuando se iluminan con luz ultravioleta.
Recultivo: una vez recuperado el material vegetal debe ser recultivado; para ello se utilizan, en general los mismos medios y condiciones en que crecía antes de su congelamiento.
Autor, Gomez J, Murcia C.
correo: [email protected]