Aprendé de Electroforesis y hacela vos mismo!

HOLA TARINGUEROS!!!

Hoy les voy a mostrar un poco de la ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA. Primero les dejo un poco de informacion de lo que es la electroforesis en gel y para que sirve, luego les dejo una animacion flash para que pueden hacerla uds mismos y al final les dejo los datos precisos para hacer la electroforesis. Ahi va:






ELECTROFORESIS



INTRODUCCIÓN:



La electroforesis es un proceso que se utilizapara separar macromoléculas de una solución. La electroforesis en agarosa permite separar moléculas de DNA, cuando éstas son sometidas a un campo eléctrico y atraídas hacia el polo opuesto a su carga neta. Hay dos fuerzas de acción opuesta que determinan la velocidad de la partícula. Primero, la fuerza eléctrica atrae el DNA hacia el electrodo y la intensidad de la atracción es directamente proporcional a la carga. Segundo, la fuerza de rozamiento se opone a la migracion y su intensidad depende del tamaño y la forma de la particula.



El DNA está compuesto por cuatro nucleótidos que tienen carga negativa y peso molecular similar. Por lo tanto, la aceleración impuesta por la fuerza electrica es igual para cualquier molecula de acido nucleico. La diferencia en velocidad de migración estará dada por diferencias en la fuerza de rozamiento, o sea por la forma y tamaño de la molécula de DNA. En el caso del DNA doble cadena, la forma es la misma para cualquier molécula, entonces las distintas moléculas tendrán una velocidad que sólo dependerá de su tamaño, es decir, de su longitud en pares de bases.




Para lograr una separación eficiente se utiliza un medio soporte que aumenta la fricción recibida por las macromoléculas y reduce la difusión al mínimo. Este medio es un polímero orgánico, conocida como gel, por su consistencia gelatinosa. Las mezclas de DNA de diferentes tamaños se hacen migrar a través del gel durante cierto tiempo y se obtiene una separación en el que la distancia migrada por una molécula es inversamente proporcional a su longitud en pares de bases (tamaño).







ELECTROFORESIS VIRTUAL:

Acá está la animacion para hacer la electroforesis, primero te explica un poco lo que vas a hacer y después ya interactuas vos con los elementos. Yo les recomiendo usarlo en pantalla grande. Abajo de la animación les dejé los pasos que van a seguir en la misma:




link:



Aca esta la EXPLICACION PASO A PASO de la animacion:

1) Fabricacion del gel:

-Agregar la agarosa solida a un frasco.
-Agregar el buffer para disolver la agarosa.
-Colocar el fresco en el microondas por un tiempo.
-Agregar la solución a la cuba.
-Colocar el peine para hacer las calles.
-Dejar solidificar y luego quitar el peine con cuidado.

2) Configuracion de la caja de electroforesis:

-Poner solución buffer en la caja de electroforesis.
-Colocamos la cuba en la solución anterior.

3) Visualizacion de la muestra de ADN en el gel:

-Tomar buffer decarga con una micropipeta.
-Mezclar con la muestra de ADN en un eppendorf.
-Tomar esta mezcla con la micropipeta y volcar en una calle de la cuba.
-Tomar con la micropipeta(con otro tip) los Standard de tamaño.
-Colocar esta solución en la 2da calle.

4) Conexión de la corriente eléctrica y corrida del gel:

-Enchufar los cables de la caja de electroforesis.
-Encender el aparato (se aplica una diferencia de potencial).

5) Tinción del gel y análisis de los resultados:

-Se quita el gelde la cuba.
-Se introduce el gel en un recipiente lleno de bromuro de etidio.
- Luego de un tiempo se retira el gel y expone a radiación UV.
-Se analizan los resultados.






Aca les dejo una EXPLICACION DETALLADA:


¿Como preparar la gelatina de agarosa?


1) Determinar la concentración y el volumen degelatina que se necesita. Si el DNA tiene un tamaño desconocidose debe utilizar una gelatina de agarosa al 1.0% (1g/100 ml) en unaplato de gelatina pequeño (30 ml).

2) Preparar la gelatina al porciento deseadosegún se indica en el siguienteejemplo:
Ejemplo: preparar 30 ml deagarosa al 1.0% (1g/100 ml)
Hay que determinar cuanta agarosa se necesitapara preparar 30 ml
(30 ml)(1 g/100 ml) = (X g)
Se despeja la ecuación para la X
El resultado es 0.3g

3) Pesar la cantidad de gelatina que se necesita(ejemplo 1 = 0.3 g) y transferir a un frasco Erlenmeyer.

4) Añadir el volumen deseado de solución amortiguadoraTris Borato EDTA(TBE) 0.5X (ejemplo 1 = 30 ml).

5) Calentar en un horno microondas hasta que sedisuelva la agarosatotalmente (aproximadamente 1 minuto). Cuando la agarosa se disuelvacompletamente lasolución se tornará clara.

6) Enfriar la agarosa hasta 50 ºC.

7) Colocarla peinilla (comb) en el plato de gelatina.

8) Echar la solución de agarosa en el plato deagarosa evitando la formaciónde burbujas. Sise forman burbujas, se pueden remover usando una punta(tips).

9) Dejar que la gel se solidifiquea temperatura ambiente (aproximadamente30minutos). La gel sólida tiene una aparienciaopaca. Para que la gelquede deun espesor uniforme, el plato de gelatina debe estar en unasuperficie planaque esté nivelada.






¿Como cargar la gelatina y empezar la electroforesis?

1) Colocar la gelatina dentro de la cámara decorrer la electroforesis.

2) Añadir suficiente TBE 0.5X hasta cubrircompletamente la gelatina(aproximadamente 0.5 cm sobrela gelatina).

3) Cargar cuidadosamente ~ 10 ul demuestra por pozo utilizando unamicropipeta. Deigual manera cargar todas las muestras deseadas. Incluiren lagelatina una muestra conteniendo un marcador de peso molecular.

4) Conectar el equipo de electroforesis. Unirlos electrodos positivos(rojos)y negativos (negros) a los terminales correspondientes.

5) Prender el equipo, seleccionar el voltaje deseado (aproximadamente 100voltios). Siel equipo está funcionando bien, entonces se podrán observarburbujas saliendo de los electrodos. Debe asegurarse de que las muestrasestán corriendoen la dirección correcta, hacia el electrodo positivo.

6) Corre la electroforesis hasta que las muestrasse hayan movidoaproximadamente entre la mitad ytres cuartos del plato de gelatina.

7) Apagar el equipo.




¿Como visualizar el DNA en la gelatina?

1) Colocar la gelatina en una solución de 0.025%azul de metileno por 30 minutos. La gelatina debe quedarcompletamente sumergida en la solución.

2) Desteñir la gelatina en agua destilada por 30minutos. La gelatina debequedar completamentesumergida en la solución.

3) El DNA se torna visible cuando se observa enuna lámpara de luz visible.

4) Fotografiar la gelatina usando una cámaraPolaroid (o equivalente).