Biblioteca genómica: conjunto de clones de una determinada especie que en conjunto cubre todo el genoma de dicha especie.
Clon: Concepto molecular: Una secuencia de DNA que dentro de un vector se encuentra en una célula huésped.
Vectores:
Plásmidos
Cosmidos
Fagos
BAC
YAC
Huésped:
Procariota (bacteria)
Eucariotas (no es tan comun para clonar Ej. Levaduras).
Parámetros a considerar:
DNA genómico
1. Pureza (medida en espectrofotómetro); (geles de agarosa).
2. Integridad (geles de agarosa).
3. Cantidad (ambos geles de agarosa, espectrofotometría).
Enzimas de restricción:
1. Preferentemente, enzimas que reconozcan sitios de 6 pb.
2. Preferentemente, enzimas que generen extremos cohesivos.
3. Preferentemente, la restricción debe ser parcial (porque es mas fácil conocer el genoma).
Vector de clonación:
1. Tamaño del fragmento que es capaz de portar.
2. Tiene que ser cortado con la misma enzima de restricción que el DNA genómico.
3. Agente selectivo que tiene el vector; (el que nos permite identificar los vectores y los huéspedes de interés.
Célula huésped:
1. Bacteria (E. Coli) - Debe ser COMPETENTE.
2. No tiene que tener plásmido.
3. Manipulada a nivel nutricional para evitar escapes.
Ejemplo:
Plasmido + adn cromosomico se liga (ligaza)vector recombinante se trasfiere a bacterias en estado receptivo y luego antibioticos y mueren las que no poseen el vector o por un analogo de lactosa de color azul se selecciona.
Problemas:
Demasiadas copias de heterocromatina.
Error tecnico.
Dos copias iguales por cromosomas.
Biblioteca por cromosoma: se separa cromosomas por electroforesis por campo pulsado.
Bilioteca ADNc: solo adn de ARNm, se utiliza cola poli-T para seleccionar ARNm. Se evita restriccion. Es ADN codificante. Sonada a tarves de intrones o exones.
A: SONDA ADN SINTETIZADA O ESPECIE HOMOLOGA
B: SONDA ADN O PROTEINA
C: SONAD ADN
D Y E: MARCADOR SELECCION DEL GEN IDENTIFICA CELULA
Genómica: Aplicación de distintas técnicas de estudio para obtener una comprensión global de la estructura y funcionamiento de los genomas.
Genómica:
1. Estructural: Genómica propiamente dicha
Técnicas de construcción de bibliotecas genómicas, marcadores moleculares de DNA.
2. Funcional: Post-Genómica.
Transcriptómica
Proteómica
Metabolómica
Fenómica
Marcadores moleculares de DNA: Son polimorfismos en la secuencia de DNA generados por las:
1. Enzimas de restricción
2. Reacción de la cadena de la polimerasa (PCR)
3. Combinación de ambas
Se aplican a poblaciones, se utilizan para caracterizar genomas y para construir mapas cromosómicos (mapas de ligamiento o de recombinación).
Genómica es el campo de la genética que intenta comprender la composición, orden,
(1) función
(2) y evolución
(3) de la información genética contenida en un genoma completo.
Genómica Estructural:
Mapas o cartografías: Pueden ser:
1. Genéticos: (orden relativo, % de recombinación, fenotipo, desventaja).
2. Físicos:
Detallado.
Distancia: (dado por n° de pb).
Genómica: Aplicación de diferentes técnicas de estudio para obtener una comprensión global de la estructura y funcionamiento de los genomas.
• Estructural: genómica propiamente dicha (técnicas de construcción de bibliotecas genómicas, marcadores moleculares de ADN).
• Funcional: transcriptómica, proteómica, metabolómica y fenómica.
Mapas físicos por restricción.
1º corte de material genético con una 1º enzima de restricción.
2º corte de material genético con una 2º enzima de restricción.
3º corte de material genético con las dos enzimas de restricción.
Marcadores moleculares: Funcionan como señaladores de diferentes regiones del genoma. Se aplican a poblaciones, se utilizan para caracterizar genomas y para construir mapas cromosómicos (mapas de ligamiento o de recombinación), como el primer paso para encontrar la posición e identidad de un gen.
Permiten evidenciar variaciones (polimorfismos) en la secuencia del ADN entre dos individuos, generados por enzimas de restricción, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y combinación de ambas, modifiquen estas o no su fenotipo. Esto se debe a que los marcadores moleculares “señalan” tanto regiones codificantes como no-codificantes del genoma.
Marcadores moleculares de ADN generados por restricción.
RFLP: polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción o RFLP (del inglés Restriction Fragment Length Polymorphism) se refiere a secuencias específicas de nucleótidos en el ADN que son reconocidas y cortadas por las enzimas de restricción (también llamadas endonucleasas de restricción) y que varían entre individuos.
Las secuencias de restricción presentan usualmente patrones de distancia, longitud y disposición diferentes en el ADN de diferentes individuos de una población, por lo que se dice que la población es polimórfica para estos fragmentos de restricción.
La técnica RFLP se usa como marcador para identificar grupos particulares de personas con riesgo a contraer ciertas enfermedades genéticas, en ciencia forense, en pruebas de paternidad y en otros campos, ya que puede mostrar la relación genética entre individuos.
Se basa en la detección de fragmentos de ADN de distinto peso molecular en diferentes organismos. La técnica está basada en la digestión del ADN total de un individuo con diferentes enzimas de restricción. Esta restricción produce cantidades equimolares de fragmentos para una molécula de ADN dada. Los fragmentos resultantes son separados por electroforesis en geles de agarosa y transferidos por capilaridad a una membrana de nylon (Southern Blot). Esta membrana es hibridada con una sonda radioactiva. El producto de la hibridación es visualizado por medio de una autorradiografía de rayos-X, de acuerdo al peso molecular de la banda.
• Si la sonda reconoce todos los alelos, el RFLP es un marcador codomimante (situación ideal).
• Si un alelo no es reconocido, se denomina alelo nulo y el RFLP se comporta como marcador dominante (situación deseada).
• El polimorfismo molecular de RFLP se genera por una combinación sonda por enzima de restricción.
Ventajas
• Son marcadores codominantes (Ej. se pueden visualizar los tres alelos polimórficos de un locus).
• Pueden utilizarse para detectar loci homólogos a través de especies emparentadas.
• Son altamente reproducibles dentro y entre laboratorios.
Desventajas:
• Requerir para realizar los ensayos grandes cantidades de ADN (5 - 10 μg).
• Necesidad de disponer de sondas radiactivas, aunque ya se han desarrollado métodos de detección no radiactivos.
• Es una técnica laboriosa, demanda gran cantidad de tiempo y es difícil de automatizar.
VNTR o minisatélites: Las secuencias de ADN de minisatélites (VNTR) son secuencias repetidas que se presentan en eucariontes. Ellas se encuentran repetidas en tándem (una detrás de la otra) y dispersas a través del genoma. Cada VNTR tiene distinto número de repeticiones variable, asociándose de esta manera un tamaño distinto a cada alelo. Existen dos formas de detectar los VNTR ya sea por hibridación o por técnicas de PCR.
Técnicamente es muy similar a los marcadores RFLP, sin embargo, difiere en la naturaleza de la sonda. En este caso se hibrida una sonda que es homóloga a la secuencia del motivo central del minisatélite.
Ventajas.
• Codominantes.
• Multialélicos.
• Repetible.
Desventajas.
• Requieren mucho ADN de partida.
• Son costosos
• Laboriosos.
Marcadores moleculares de ADN generados por PCR.
RAPD: Involucra el uso de un primer de secuencia "arbitraria" en una reacción de PCR, resultando en la amplificación de productos discretos de DNA. Cada producto deriva de una región del genoma que contiene dos segmentos cortos de secuencia similar a la del primer, ubicados en cadenas opuestas y suficientemente cerca (200 a 3000 pb) para permitir la amplificación. Los productos de amplificación se separan en geles de agarosa y se visualizan mediante luz UV. Los polimorfismos se detectan como presencia o ausencia de bandas y son resultado principalmente de diferencias de secuencias en uno o ambos sitios de pegado del primer.
Ventajas.
• Requieren poco ADN de partida.
• Son baratos.
• Poco laboriosos (rápidos)
Desventajas.
• Es un marcador dominante.
• La precisión es baja.
• Poco repetibles.
SSR o microsatélites: Se trata de regiones constituidas por repeticiones en tándem de unos pocos pares de bases (1 a 6). El polimorfismo de estas regiones está dado por los diferentes números de repeticiones, dando fragmentos amplificados por PCR de distinto tamaño. Aquellos alelos con mayor número de repeticiones, tendrán un tamaño mayor y correrán más retrasados en una corrida electroforética.
Ventajas.
• Poca cantidad de ADN de partida.
• Muy precisos.
• Alta repetibilidad.
• Bajo costo.
• Rapidez.
Desventajas.
• Generalmente están patentados, si lo están es porque hay que desarrollarlos y es costoso.
SRAP: Se utilizan dos primers uno con alto contenido en AT, que tiene altas probabilidades de anillar a promotores o a intrones, y otro con alto contenido en GC, que tiene altas probabilidades de anillar a exones.
Amplifica preferentemente regiones expresables.
El polimorfismo viene dado por presencia o ausencia.
Ventajas.
• Requiere poco ADN.
• Se detectan polimorfismos en zonas expresables.
• Se pueden ver muchos loci simultáneamente.
Desventajas.
• Amplificación poco especifica.
• Se comporta como dominante.
Secuenciación de ADN: La secuenciación de ADN es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T) en un fragmento de esta molécula. La primera generación de técnicas para secuenciar el ADN empezó en 1975 con la metodología de Sanger y Coulson, llamada “más y menos” (del inglés, “plus and minus”), la cual necesitaba clonar cada fragmento inicial de “lectura” para producir un ADN de cadena simple.
En 1977, Maxam y Gilbert publicaron la metodología de secuenciación de ADN mediante degradación química. Este método estaba basado en la modificación química y posterior rotura del ADN, y empezó a ser el método de secuenciación más utilizado porque permitía utilizar un ADN purificado sin necesidad de clonarlo.
En 1977 Sanger publicó su método de secuenciación de ADN por síntesis química llamado método de terminación de la cadena, el cual se convirtió en el método más utilizado en los siguientes 30 años. En este método se utilizan pocos reactivos tóxicos y cantidades menores de radiactividad que en el método de Maxam-Gilbert, y su característica particular es el uso de didesoxinucleótidos trifosfato (ddNTPs) como terminadores de la cadena de ADN.
Los ddNTPs son desoxinucleótidos de las 4 nucleótidos diferentes (dATP, dTTP, dCTP y dGTP) que carecen de uno de los grupos hidroxilo, de manera que cuando uno de estos nucleótidos se incorpora a una cadena de ADN en crecimiento, esta cadena no puede continuar elongándose ya que la enzima ADN polimerasa necesita un extremo 3’ OH para añadir el siguiente nucleótido, y el ddNTP incorporado carece de este grupo hidroxilo. Al terminar la elongación de la cadena, se producen varios fragmentos de ADN de longitud variable, los cuales son desnaturalizados por calor y separados por tamaño (con una resolución de un solo nucleótido) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida - urea. Cada una de las cuatro reacciones de síntesis se corre en calles individuales (A, T, G y C) y se visualizan las bandas de ADN mediante autorradiografía o luz ultravioleta. Las bandas obtenidas en el gel corresponden a los fragmentos de ADN de diferentes longitudes. Una banda en una calle indica un fragmento de ADN que es el resultado de una terminación de la cadena tras la incorporación de un didesoxinucleótido (ddATP, ddGTP, ddCTP o ddTTP). El nucleótido terminal puede ser identificado de acuerdo al didesoxinucleótido que se añadió en la reacción que dio lugar a esa banda. Las posiciones relativas entre las cuatro calles se utilizan entonces para leer (de abajo a arriba) la secuencia de ADN.
MARACADORES MOLECULARES DE ADN: DETECATADOS POR PCR:
• Intermicrosatélites: (ISSR) utiliza como primer un microsatélite (forward y reverse). No se necesita conocer la secuencia del microsatélite para el diseño de primers.
AT AT AT AT AT AT------ ISSR----- AT AT AT AT AT
• Polimorfismo en geles de poliacrilamina en desnaturalización de ADN, por:
1) presencia o no de dos ISSR, franqueo de una región de ADN de tamaño adecuado para amplificación como dominante)
2) longitud de la región de ADN entre los SSR. Sin embargo se controla también como dominante.
Se analiza presencia y ausencia. Los rojos son monomorfos, (d y f). Y los demás son polimorficos.
Ventaja adicional por cada PCR se puede analizar gran número de loci.
AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism, (polimorfismo en la longitud de los fragmentos amplificados) consiste en la combinación de los métodos de PCR y análisis de fragmentos restricción, con el fin de detectar polimorfismos debidos a modificaciones en la secuencia de ADN que comprende los sitios de corte de las enzimas de restricción. Este cambio se percibe como un patrón diferente, en número y tamaño, de bandas generadas.
1) Restricción doble con extremos pegajosos:
- enzimas de corte raro (I y III) sitios de 6 pb.
- enzimas de corte frecuente (II) 4 pb.
2) Ligación con adaptadores específicos:
Oligonucleótidos que presentan “colas” complementarias a los cortes pegajosos específicos de la enzima de restricción. Detectados por PCR y restricción.
3) PRE- amplificación: los adaptadores se utilizan como primers, una secuencia de simple hebra complementaria a cada uno de los adaptadores más una base selectiva. (El primer se mete en el ADN geonómico y amplifica), solamente a aquellos que tiene la secuencia de reconocimiento de la enzima.
-primer: más de uno, selectivos de los cortes de las ER que permiten eliminar ¾ de los fragmentos recombinantes.
4) Amplificación selectiva: se repite paso 3, pero se agregan 2 nucleótidos mas al primer (primer + 3 nucleótidos). Resultado población de fragmentos amplificados.
5) corrida en geles de poliacrilamida desnaturalizante.
Presencia o ausencia. Marcador dominante.
Desventajas:
-marcador dominante
- e$tan patentado$.
Ventajas:
- mucha cantidad de datos
SCAR: Sequence characterized amplified region, a) digerir fragmentos polimórficos generados con marcadores RAPD o RFLP en lugar de clonarlos, b) secuenciar los fragmentos digeridos y c) alinear las secuencias para diseñar oligos específicos. Esta estrategia permitió comparar de manera más rápida y sencilla regiones variables útiles, se reduce cantidad de pasos y se vuelven codominantes.
SNP/ esnip: Single Nucleotide Polymorphism, Polimorfismo de nucleótido simple.
No cambian mucho de una generación a otra, es sencillo seguir su evolución en estudios de poblaciones. Son una forma de mutación puntual.
Un método extendido para la detección de SNP es el de polimorfismo en la longitud de fragmentos de restricción (SNP-RFLP). Si un alelo contiene un punto de reconocimiento para una enzima de restricción mientras que otro no, la digestión de los dos alelos genera fragmentos de diferente longitud. Si no existe este punto discriminatorio para la enzima de restricción, a menudo puede introducirse mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
M1
Cada marcador se ajusta a una segregación mendeliana. 20 marcadores, 20x¾=15 20x¼=5, se cuentan y se prueba si es segregación mendeliana se eliminan los que no son una segregación conocida y con los que se tiene se plantea su independencia o segregación. Mediante Chi-cuadrado.
Bioinformática: es la aplicación de tecnología de computadores a la gestión y análisis de datos biológicos. Campos de estudios interdisciplinarios muy vinculados, que requieren el uso o el desarrollo de diferentes técnicas que incluyen informática,[matemática aplicada, estadística, ciencias de la computación, inteligencia artificial, química y bioquímica para solucionar problemas, analizar datos, o simular sistemas o mecanismos, todos ellos de índole biológica, y usualmente (pero no de forma exclusiva) en el nivel molecular. El núcleo principal de estas técnicas se encuentra en la utilización de recursos computacionales para solucionar o investigar problemas sobre escalas de tal magnitud que sobrepasan el discernimiento humano. La investigación en biología computacional se solapa a menudo con la biología de sistemas.
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) es un programa informático de alineamiento de secuencias de tipo local, ya sea de ADN o de proteínas. El programa es capaz de comparar una secuencia problema, contra una gran cantidad de secuencias que se encuentren en una base de datos. El algoritmo encuentra las secuencias de la base de datos que tienen mayor parecido a la secuencia problema. Es importante mencionar que BLAST usa un algoritmo heurístico por lo que no nos puede garantizar que ha encontrado la solución correcta. Sin embargo, BLAST es capaz de calcular la significación de sus resultados, por lo que nos provee de un parámetro para juzgar los resultados que se obtienen. Tipos:
Blastn: más usados. Compara una secuencia de nucleótidos contra una base de datos que contenga también secuencias nucleotídicas.
Blastp: Es un BLAST "con huecos" (o gaps) que compara una secuencia de aminoácidos contra una base de datos del mismo tipo.
BlastX: Este programa usa como entrada una secuencia de nucleótidos. Traduce la secuencia en sus seis posibles marcos de lectura (tres marcos de lecturas por hebra) y compara estas secuencias traducidas contra una base de datos de proteínas. Se usa cuando se tiene sospecha de que la secuencia de entrada codifica para una proteína pero no se sabe exactamente cuál es su producto.
TBlastn: Compara una secuencia proteica con una base de datos de nucleótidos. Para realizar esto traduce todas las secuencias de nucleótidos en sus seis marcos de lectura. Se usa cuando se tiene una proteína, y el análisis con Blastp no ha sido exitoso, pero una buena cantidad de las secuencias traducidas no son proteínas que existan en la naturaleza.
TBlastX: combinación del TBlastn con el BlastX. Compara una secuencia de nucleótidos contra una base de datos de nucleótidos, pero primero traduce tanto la secuencia problema como la base de datos a proteínas, usando los seis marcos de lectura posibles. La mayoría de los servidores públicos no aceptan usar esta opción en combinación con las bases de mayor tamaño debido a que la búsqueda es muy intensiva computacionalmente.
Bl2seq: compara dos secuencias entre ellas, en vez de comparar una secuencia con una base de datos. Al usar el mismo algoritmo de BLAST, este programa no es recomendable para secuencias donde las regiones de similitud están muy separadas.
Base de datos: es un conjunto de datos pertenecientes a un mismo contexto y almacenados sistemáticamente para su posterior uso. En este sentido, una biblioteca puede considerarse una base de datos compuesta en su mayoría por documentos y textos impresos en papel e indexados para su consulta. En la actualidad, y debido al desarrollo tecnológico de campos como la informática y la electrónica, la mayoría de las bases de datos están en formato digital (electrónico), que ofrece un amplio rango de soluciones al problema de almacenar datos.
Genómica comparativa: La complejidad de la evolución del genoma plantea muchos desafíos excitantes a desarrolladores de modelos matemáticos y algoritmos.
Técnicas de análisis de ARN:
1) extracción de ARN métodos similares a los empleados para extraer solo que se emplean ADNasa.
2) Medición de calidad y pureza.
3) Restrotranscribir a ADNc(para la estabilidad)
4) Técnicas de análisis: Nothern blot, micoararays, cDNA AFLP.
Nothern blot: (no es necesario retrotranscribir) se toma la mezcla de ARN y se somete a una electroforesis en gel a fin de separar los fragmentos en base a su tamaño. Tras esto, se transfiere el contenido del gel, ya resuelto, a una membrana cargada positivamente en la cual se efectúa la hibridación de una sonda molecular marcada radiactiva o químicamente.
Differential display y cDNA AFLP: en general se estudian ARNm (expresión de genes estructurales). En la PCR reversa se utiliza primers poli-T que se hibrida en la cola poli-A que se agrega a los ARNm y un primer al azar en general de una base. El resultado es el ADN copia.
En el differential display, los resultados de esta PCR reversa, mezcla heterogenea de cDNA se amplifica con el primer la azar (disminuye bandas) y es similar a RAPID.
Esta reacción se produce en las dos situaciones constranstantes, los productos de amplificación de correr geles de poliacrilamina y se comparan las diferencias.
1) control negativo
2) muestra hígado ratón sano
3) muestra hígado ratón enfermo
4) muestra positiva.
Se sigue con los polimorfismos que aparecen 2 o 3, polimorfismos de expresión.
Se corta l pedacito de interés y lo secuencias.
Si no es polimorfismo muy marcado se cambia los primers.
Para generar más polimorfismo, se puede aplicar cADN-AFLP: ADNc con ER, se liga, amplifica y corre en gel.
En la aplicación de AFLP a un ADNc.
Ventaja: aumenta número de bandas (mayor polimorfismo). No es importante la dominancia y codominancia.
Desventaja: mas caro y mas tiempo.
Micoarreys o microarreglos: chips de ADN. Son soportes sólidos en los cuales se encuentran inmovilizados, en un área pequeña, de cientos a miles de genes de manera ordenada. Pueden ser similares a un portaobjeto para microscopio, placa de sílice o membranas de nylon. En los microarreglos, el DNA puede ser impreso, depositado o sintetizado directamente sobre la superficie sólida. Son sondas de un gen.
Matriz en solución: moléculas de ADNc de hígado de ratón sano marcados en verde.
Moléculas de ADNc extraídas de ARNm de hígado de ratón enfermo marcadas de color rojo.
Se crea la placa, y luego se revela. Amarillo posee los dos (monomorfismo).
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Proteínas de quimericas: Para conseguir estas proteínas, hay que hacer una construcción genética en la que se une, manteniendo el marco abierto de lectura adecuado, el gen de la proteína a fusionar, por ejemplo, un gen del huésped, con el gen que queremos expresar. Se introduce en coli en geen de la proteina de interes con su regulación para obtener mas o menos producto.
Proteína de fusión : Proteína elaborada con un gen de fusión, que se crea al unir partes de dos genes diferentes. Los genes de fusión se pueden presentar de forma natural en el cuerpo mediante la transferencia de ADN entre los cromosomas. Los genes de fusión y las proteínas también se pueden producir en el laboratorio al combinar genes o partes de los genes de un mismo organismo o de organismos diferentes.
Transformación genetica de plantas.
-plasmido Ti (agrobacteium tumefaciem)
-biovalistica. ( cañón genético aceleración de partículas, microinyección, electroporación).
Introducen: resistencia a virus, insectos, herbicidas (hongos)
Ratones transgénicos. Después de la penetración por el espermatozoide un óvulo de ratón fertilizado contiene dos pronúcleos. Uno del espermatozoide y uno del óvulo. Éstos pro núcleos se pueden manipular mediante agujas de vidrio huecas, finas, donde se inyecta el ADN directamente en uno de los pronúcleos de un óvulo fertilizado.
Se insertan unos pocos cientos de copias de ADN lineal clonado en un pronucleo y, en alguno de los óvulos inyectados, las copias del ADN clonado se integran al azar en uno de los cromosomas mediante un proceso denominado recombinación no homologada. Después de la inyección los embriones se implantan en una hembra pseudopreñada. Sólo alrededor del 10 al 30% de los óvulos sobreviven y, de estos, sólo algunos tienen una copia del ADN clonado integrado en forma estable en un cromosoma. Debido a que el ADN fue inyectado en estadio unicelular del embrión, estos ratones suelen portar el ADN clonado en todas las células de su cuerpo, incluso en sus células reproductoras y, por consiguiente, pasará el ADN extraño a su progenie. A través del intercruzamiento pueden crearse uno cepa de ratones homocigóticos para el gen extraño. Se dice que los animales alterados en forma permanente de esta manera son transgénicos y el ADN extraño que portan se denomina transgén.
Ratones con desactivación génica: (knockout). Una variante muy útil del enfoque transgénico consiste en producir ratones en los cuales se ha desactivado un gen normal. Los fenotipos estos animales, denominados ratones con desactivación génica o knockout, ayudan a los genetistas a determinar la función de un gen. La creación de estos ratones comienza cuando se clona un gen normal en las bacterias y luego se lo ``noquea`` o desactiva.
Existen varias maneras de desactivar un gen, pero un método común es insertar un gen denominado neo, que confiere resistencia al antibiótico G418, en el medio del gen objetivo.
La inserción de neo rompe o noquea el gen blanco y proporciona un marcador conveniente para el encuentro de copias del gen desactivado. Además, se clona un segundo gen, por lo general el gen timidinacinasa (tk) viral del herpes simple, adyacente al gen deteriorado. Luego el gen desactivado se transfiere a cultivos de células embrionarias de ratón donde puede intercambiar los lugares con la copia cromosómica normal por medio de recombinación homologa.
CONCEPTOS:
•Los ratones transgénicos son producidos por inyección de ADN clonado en el pronúcleo de un ovulo fertilizado, seguido por la implantación de éste en un ratón hembra.
•En los ratones con desactivación génica (knockout) el ADN inyectado contiene una mutación que desactiva un gen. Dentro del embrión del ratón la copia desactivada del gen puede intercambiarse con la copia normal del gen a través de la precombinación homologa.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION: High performance liquid chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografía en columna utilizada frecuentemente en bioquímica y química analítica. El HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las substancias analizadas y la columna cromatográfica.
La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil. En cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija. La cromatografía líquida “clásica” se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la cual está rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas.
1. Cromatografía de adsorción. La fase fija es un sólido y se utiliza casi exclusivamente sílice (sílica) y en mucha menor medida alúmina.
2. Cromatografía de reparto. En casi todos los casos, como fase estacionaria se utilizan compuestos unidos químicamente a un soporte sólido de sílica. Se la subdivide encromatografía en fase normal y fase reversa.
En la cromatografía en fase normal, la fase fija es polar (como por ejemplo agua o trietilenglicol) y los compuestos menos polares eluyen primero.
En la cromatografía en fase reversa, el compuesto unido químicamente es un hidrocarburo alifático y se emplean fases móviles polares. En este caso, las sustancias más polares eluyen primero.
3. Cromatografía iónica. Se utilizan columnas rellenas con resinas de intercambio iónico para separar y determinar iones.
4. Cromatografía de exclusión por tamaño. La fase fija está formada por partículas poliméricas o de sílice que contienen una red uniforme de poros y llevan a cabo un fraccionamiento relacionado con el tamaño molecular.
Las moléculas de tamaño mayor son excluídas y eluyen primero, mientras que las más pequeñas que penetran en los poros son retenidas más tiempo.
ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL. EQUIPAMIENTO DISPONIBLE.
“Proteoma” : describe el conjunto de proteínas que se expresan a partir de un genoma en un momento dado. El Proteoma es un elemento altamente dinámico, cuyos componentes varían en un organismo, tejido, célula o compartimento subcelular, como consecuencia de cambios en su entorno, situaciones de estrés, administración de drogas, señales bioquímicas o su estado fisiológico o patológico.
La “Proteómica” se ha definido como la ciencia o conjunto de tecnologías que estudian el proteoma.
La electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida (2D PAGE) es la herramienta más empleada para el análisis global y la separación de los componentes del proteoma. Dicha técnica permite la separación de cientos o miles de proteínas (“spots”) en un único gel, mostrando un patrón característico. La Separación de Proteínas mediante 2D PAGE pasa por las siguientes etapas:
Preparación de la muestra:
Separación en la 1ª Dimensión (Isoelectroenfoque):En primer lugar las proteínas se separan en base a su punto isoeléctrico en gradientes de pH inmovilizados (IPGs).
Separación en la 2ª Dimensión (SDS-PAGE): Una vez que las proteínas han sido separadas en función de sus propiedades eléctricas, pasamos a separarlas en función de su tamaño o peso molecular mediante la electroforesis en geles de acrilamida en presencia de dodecil-sulfato sódico (SDS).
Estas dos separaciones sucesivas permiten aislar prácticamente todas las proteínas de un proteoma en una matriz bidimensional (“electroforesis bidimensional”).
Tinción: Para visualizar las proteínas en el gel, éstas deben ser teñidas de alguna manera. La elección del método de tinción viene determinado pordiferentes factores, como la sensibilidad deseada, rango lineal, facilidad de uso, precio y tipo de equipo de adquisición de imagen disponible. Los métodos más usados son la tinción con Coomassie Blue, la tinción fluorescente con
Sypro Ruby y la tinción con Plata, aunque esta última no es del todo compatible con el análisis posterior de las proteínas por espectrometría de masas.
ELECTROFORESIS: La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa. Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo).
El movimiento de las moléculas esta gobernado también por dos fuerzas adicionales; inicialmente la fricción con el solvente dificultará este movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado las moléculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energía cinética propia denominado difusión. La energía cinética de las moléculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusión.
La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una manera homogénea, de tal manera que, si las moléculas son colocadas en un cierto lugar de solución, los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo.
Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga mas resistencia a dicho movimiento. Una forma común de hacer esto es formar un gel. El gel consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos, consecuentemente, la migración electroforética de las moléculas será mas lenta, pero el ensanchamiento del frente se vera reducido también.
Métodos electroforeticos zonales. Son los más comunes, dada su alta aplicabilidad en diferentes campos. Son útiles para lograr la separación de mezclas complejas. Se aplican pequeñas cantidades de la disolución de proteínas a un soporte sólido, que se impregna con una solución tampón. Los soportes son en general polímeros y forman un gel poroso que restringe el movimiento de las moléculas a través del medio durante la electroforesis y disminuyen los flujos de convección del solvente.
Como soporte han sido utilizados papel (celulosa), almidón, poliacrilamida, agarosa y acetato de celulosa, entre otros. Este método tiene gran poder resolutivo por que se aplica una cantidad pequeña de proteína a una zona estrecha, mientras que la longitud del trayecto es mucho mayor que la zona de aplicación. El equipamiento requerido es simple, fuente de poder, cubeta vertical u horizontal donde se colocan el soporte y dos electrodos Los más utilizados son:
Electroforesis en gel de poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida se forman por polimerización de la acrilamida por acción de un agente entrecuzador, es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rápida y reproducible. Forma, además, geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que permiten buena visualización de las bandas durante un tiempo prolongado. Además tiene la ventaja de que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de manera controlada en el tamaño del poro, lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su neurotoxocidad.
Electroforesis en geles de gradientes. El uso de geles de poliacrilamida que tienen un gradiente creciente de concentración de archilamida + bisacrilamida, y en consecuencia un gradiente decreciente en el tamaño del poro, pueden tener ventajas sobre los geles de concentraciones uniformes de acrilamida. En un gel en gradiente la proteína migra hasta alcanzar una zona donde el tamaño de poro impida cualquier avance. Una vez se alcanza el limite del poro no se produce una migración apreciable aunque no se detiene completamente. Una de las ventajas de este tipo de geles es que resuelve mejor las bandas pues las concentra en regiones mas estrechas, además de incrementar el rango de pesos moleculares que se pueden resolver en un mismo gel comparado con los de una concentración fija.
Electroforesis en geles de agarosa. La agarosa posee la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados y formar un gel, semisólido al enfriarse. Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las moléculas, se usa usualmente para separar moléculas grandes de alrededor 20.000 nucleótidos.
Electroforesis capilar. La electroforesis capilar se basa en los mismos principios de las técnicas electroforeticas convencionales, pero utiliza condiciones y tecnología distinta que nos permiten obtener una serie de ventajas al respecto, Esta separación de péptidos realizada sobre un capilar de silica fundida a potenciales elevados 20 a 30 Kv en un campo de 400 a 500 v/cm refrigerados por aire. La corriente electroendosmótica (FEO) generada por los grupos silanol de la superficie interna del capilar da como resultado una corriente plana del frente del líquido que contrasta con el frente parabólico de la cromatografía líquida de alta resolución . La ventaja de esta técnica es que el capilar de silica fundida que generalmente se cubre con una capa de polimina para darle mayor rigidez y resistencia, tiene una ventaja a través de ella que permite el pasaje de la luz UV de tal manera que la visualización es on-line. Con esta técnica descripta es posible separar cationes, aniones, proteínas, macromoléculas y sustancias no cargadas en forma simultánea. Isoelectroenfoque. Esta técnica, habitualmente denominada electroenfoque se basa en el desplazamiento de las moléculas en un gradiente de pH. Las moléculas amfotéricas, como los aminoácidos, se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH . La región del ánodo es Ácida y la del cátodo es alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal que las moléculas que se han de separar tenga su punto isoeléctrico dentro del rango. Las sustancias que inicialmente se encuentran en regiones de pH inferior a su punto isoeléctrico estarán cargadas positivamente y migraran hacia el cátodo, mientras aquellas que se encuentran en medios con pH más bajos que su punto isoeléctrico tendrán carga negativa y migraran hacia el ánodo. La migración les conducirá a una región dónde el pH coincidirá con su punto isoléctrico, tendrán una carga neta nula y se detendrán. De esta forma las moléculas amfotéricas se sitúan en estrechas bandas donde coincide su punto isoeléctrico con el pH.
Electroforesis bidimensional. La electroforesis bidimensional se basa en separar las proteínas en una mezcla según sus dos propiedades moleculares, una en cada dimensión. El procedimiento más usado se basa en la separación en una primera dimensión mediante isoelectroenfoque y la segunda dimensión según peso molecular mediante electroforesis en poliacrilamida.
Fuentes de error en la electroforesis. La electroforesis es una técnica muy sensible y puede ser afectada por muchos errores experimentales, como la temperatura durante la polimerización y la corrida del gel, velocidad de la polimerización, niveles de catalizador, pureza del reactivo, tiempo de corrida y preparación de las muestras.
RADIOINMUNOENSAYO (RIA): Se mezcla una cantidad constante de antígeno marcado radioactivamente y una cantidad constante de un anticuerpo para ese antígeno. Se produce la reacción entre antígeno (Ag) y anticuerpo (Ac) se separa la fracción de antígeno que se ha unido de la que permanece libre (hay varias formas de hacerlo. En la figura inferior se utiliza un 2º anticuerpo dirigido contra el primero) se determina la radioactividad. Si la muestra contiene además antígeno frío (no marcado), éste competirá con el marcado para unirse al anticuerpo, y se observará un descenso en la medida de la radioactividad. Este descenso es proporcional a la concentración de antígeno frío en la muestra
En ausencia de antígeno frío (no radioactivo), todos los complejos Ag-Ac serán radioactivos. La radioactividad medida es máxima. En presencia de antígeno frío (no radioactivo), éste compite con el antígeno radioactivo para unirse al anticuerpo. Por tanto la radioactividad medida es menor. El descenso es proporcional a la concentración de Ag frío presente en la muestra
Se construye una curva de calibrado (color rojo) que relacione la medida de radioactividad (cpm) con la concentración de antígeno frío en la muestra
Si se realiza el ensayo con una muestra que contiene una cantidad desconocida del antígeno no marcado y se mide la radioactividad asociada a los anticuerpos, por interpolación sobre la curva de calibrado se puede estimar la concentración del antígeno frío en la muestra.
La técnica ha sido prácticamente reemplazada por el método ELISA el cual mide la unión Ag-Ac mediante colorimetrías en lugar de radiometrías.
RIA de Inhibición : Usado cuando no se puede marcar el antígeno. Se inmoviliza una cantidad constante de antígeno en un soporte sólido. Se suele saturar con BSA, leche en polvo o caseína para que no se una nada más al soporte. bSe añade una cantidad constante de Anticuerpo marcado y el antígeno frío a medir (o de calibrado). En este paso se establece una competencia en la que el Ac se une al Ag fijo al soporte o al problema. Se eliminan el anticuerpo no inmovilizado y el antígeno soluble y se determina la cantidad de anticuerpo marcado que se ha inmovilizado. Se construye una curva de calibrado representando la cantidad de anticuerpo marcado inmovilizado frente a la concentración de antígeno soluble añadida o bien se interpola la radiactividad medida en esta curva de calibrado.
RIA de Sándwich: Se inmoviliza una concentración fija del Ac1 (no marcado) en un soporte sólido. Tras lo que se satura el soporte. Se añade la muestra problema (o de calibrado) de Ag.
Se añade Ac*2 (marcado) que se una a otro epítopo del Ag. Eliminación del Ac*2 no unido.
Se determina la cantidad de anticuerpo marcado unido. A partir de una recta patrón se interpola el valor obtenido para saber la concentración de Ag presente o bien se realiza la recta de calibrado.
ELISAEnzyme Linked Immuno Sorbent Asssay).
Ensayo inmunoenzimático que se caracteriza por ser muy sensible, de alta especificidad, rápido y económico. El principio de esta metodología consiste en detectar la presencia y/o cuantificar alguna proteína de interés, como puede ser una proteína recombinante presente en muestras de alimentos derivados de un OGM. El método de ELISA se fundamenta en el uso de anticuerpos (Ac) específicos para capturar a la proteína de interés. Hay diferentes variantes de ensayos de ELISA, existen formatos de laboratorio (en soportes de muchos pocillos) y también hay formatos portátiles. En la Figura se muestra una de las posibles variantes de ELISA: en un soporte se fijan anticuerpos (Anticuerpos A) capaces de reconocer y unirse a la proteína que se pretende detectar. Además se utiliza una segunda población de anticuerpos (anticuerpos B) que genera una reacción colorimétrica o fluorimétrica que permite visualizar y medir la cantidad de la proteína de interés. El resultado se compara con la señal emitida por concentraciones conocidas de la misma proteína, por lo que el ensayo no solo es cualitativo, si no también cuantitativo.
La prueba recurre al empleo de inmunógenos, haptenos ó anticuerpos marcados con una enzima, para revelar el reactivo complementario a nivel de distintos fluidos biológicos. Aplicada posteriormente a la revelación y a la cuantificación de los más diversos tipos de sustancias presentes en líquidos orgánicos (antígenos, anticuerpos, hormonas, fármacos, etc.).
El área de sus aplicaciones médicas se ha expandido en forma sostenida, siendo utilizada como el primer sustituto de la técnica de Radioinmunoensayo en la medición de hormonas, inmunoglobulinas, antígenos y anticuerpos en infecciones bacterianas, micósicas, parasitarias o virósicas.
De un modo general se procede a la fijación de uno de los componentes de la reacción inmunológica (antígeno Ag o anticuerpo Ac) a un soporte sólido, poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario. El complejo inmunológico formado es enfrentado luego a las moléculas capaces de reconocer a su componente más superficial, marcadas con una enzima (peroxidasa de rábano picante); agregándose posteriormente un sustrato cromogénico de la enzima marcadora. La existencia de una reacción inmunológica se demuestra y se cuantifica midiendo espectrofotométricamente la cantidad de producto enzimático resultante.
Tipos de ensayos ELISA: Permiten desde la cuantificación de un antígeno en solución, la detección de un anticuerpo en una solución (por ej. en el clonaje de anticuerpos monoclonales), o la determinación de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo.
ELISA directo: (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,….) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado, o bien se le ha añadido).
ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos : uno primario contra el antígeno, y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señál debida a la unión de dos o más anticuerpo secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran cantidad de antígenos.
ELISA sandwich. (ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.