Petrucci se crio en una familia ítalo-estadounidense en Boston. Aunque sus padres no son músicos, su hermana mayor tocaba el piano y el órgano eléctrico, su hermano el bajo y su hermana menor el clarinete. Aunque su hermana influyó en sus intereses musicales hasta cierto punto, Petrucci dice que empezó a tocar la guitarra eléctrica porque todos los muchachos del vecindario tocaban y le parecía algo divertido. Estudió en la escuela de música contemporánea de Berklee en Boston, donde, junto a su compañero de secundaria John Myung, conocieron a Mike Portnoy y fundaron lo que hoy es Dream Theater, una de las bandas más reconocidas en su género.
El interés de Petrucci por la guitarra despertó al empezar a dar clases a los doce años. Fue tal la dedicación que tuvo para este instrumento, que llegó a practicar hasta ocho horas diarias con su colega y bajista John Myung. En el marco del éxito de su banda Dream Theater, ha logrado el reconocimiento y respeto de muchos músicos en el mundo debido a su notable habilidad para componer «estructuras musicales complejas y bellas». Prueba de esto, por ejemplo, es su incorporación en la gira G3 junto a Joe Satriani y Steve Vai, llegando a ser el guitarrista invitado que más veces ha participado en esta gira de guitarristas virtuosos. También se le atribuyen varias piezas de la New York Metal Orchestra o Trans-Siberian Orchestra, de la que ha sido parte en numerosas ocasiones junto a su banda Dream Theater.
En 2005 lanzo su primer y único álbum en solitario "Suspended Animation"
Actualmente, Petrucci contribuye a la revista Guitar World con una columna mensual, y también contribuyó con la escritura de las partituras para los libros de Images and Words y Awake, dos discos de Dream Theater. Tiene también un video didáctico sobre la guitarra a la venta.
Los guitarristas que más han influido en el estilo de Petrucci han sido David Gilmour (de Pink Floyd), Steve Vai, Alex Lifeson (de Rush), Brian May (de Queen), Steve Howe (de Yes, actualmente de Asia), Allan Holdsworth y el legendario Stevie Ray Vaughan. Sin embargo, su máxima influencia, y la que él cita siempre como su guitarrista favorito cuando se le pregunta, es Steve Morse.
Empezó a experimentar con una guitarra de siete cuerdas para el disco Awake, lo cual, él cree, le dio al disco un toque más pesado y que ha contribuido en la manera de componer y potenciar las posibilidades de este instrumento. Escribe activamente en su casa con su «four track studio» (consola/grabadora de cuatro canales) y siempre lleva con él un secuenciador a todas sus giras.
Actualmente, Petrucci vive en Long Island con su esposa Rena Petrucci, sus tres hijos, Sami, Reny y Kiara, y su gata Little Girl. Cuando no está tocando la guitarra, dedica parte de su tiempo libre con su familia o realizando levantamiento de pesas.