Cuantificación de Hierro Sérico- Química Analítica

Introducción
En el presente trabajo el objetivo principal es la cuantificación del catión hierro (III) presente en una muestra de suero humano que viaja unido a la transferrina. Para ello es fundamental conocer a la perfección nuestra muestra problema, tratar de abordar a fondo la función que cumple nuestro analito de interés sin perder de vista la matriz a la cual viene asociado, para por último poder elegir no solo un método de análisis certero, eficiente sino también que esté al alcance de las posibilidades que nos brinda el laboratorio.
Para comenzar es fundamental tener en cuenta como se pretende extraer la muestra. Es algo a considerar la preparación del paciente para que los resultados analíticos satisfagan las exquisitas necesidades clínicas.
Es recomendable que éste se encuentre en ayunas para disminuir considerablemente los lípidos presentes en sangre, siendo además conveniente que la extracción sea en la mañana ya que se ha detectado en pacientes una leve diferencia en la concentración de hierro diurna.
Es muy conveniente que se deje de tomar el día antes de la extracción (o dependiendo de la actividad del mismo), cualquier medicamento que pueda contener algún otro ión metálico u otro compuesto que pueda interferir en el proceso de análisis.
La jeringa a utilizar debe de estar perfectamente esterilizada y debe de ser de un calibre muy fino para evitar que se produzca hemolisis (actualmente se han desarrollado sistemas que pinchan la vena, así como tubos con tapón al vacío). Generalmente para extraer posteriormente el suero se obtiene sangre de algunas de las tres venas de la fosa antecubital.
Para la extracción se procede de la siguiente manera:
Se aplica un torniquete por encima de codo (ver figura 1-A.) para facilitar la exposición de las venas.
Una vez que se ha localizado la zona en la que se va a realizar la extracción se desinfecta previamente con EtOH.
Tras la extracción de la muestra se coloca la misma en tubos adecuados dependiendo de la metodología a utilizar. En nuestro caso es inaceptable obtener una muestra con anticoagulantes de tipo EDTA ya que este puede formar complejos con el hierro.
El suero por último se obtiene cuando la sangre es recogida en un tubo sin anticoagulantes. Generalmente los tubos son siliconados para disminuir la adhesión del coagulo y tienen gelosa que facilita la separación del suero tras la centrifugación. (1)

El resultado final se puede apreciar en la figura 1-B. en la cual podemos reconocer diferentes tubos que contienen suero. Sus volúmenes varían en función de la cantidad de suero que se necesite para hacer las pruebas. Es algo a considerar que a nivel de laboratorio preferentemente las tapas de los mismos deben ser marrones o rojas para no confundirlos con muestras similares que tengan otro destino. Evidentemente cada tubo debe ser correctamente identificado para no incurrir en errores a la hora de comunicar los resultados al paciente.
La sangre muestra inicial de la cual surge la muestra problema, el suero, es un tejido líquido de gran importancia para el cuerpo humano, cumpliendo diferentes funciones. A rasgos generales en la sangre se pueden distinguir los elementos formes (que incluyen a los leucocitos, eritrocitos y trombocitos) y una fase liquida denominada plasma sanguíneo.(4)
En el ámbito líquido aportado por el plasma los eritrocitos son los encargados de transportar dos gases vitales para los seres humanos: el oxígeno molecular (O2) y el dióxido de carbono (CO2). Este objetivo se logra fundamentalmente por la presencia de la hemoglobina, proteína globular de color rojizo, el cual es proporcionado por el catión hierro en su grupo Hemo (ver figura 2-A.)
La hemoglobina se caracteriza por ser una proteína oligomérica presente en los eritrocitos cuya estructura cuaternaria es la principal responsable del comportamiento para el transporte y la entrega de oxígeno, la cual se realiza por difusión tanto a nivel de los pulmones (cuando lo recibe) como a nivel celular.Los eritrocitos poseen una estructura similar a la de un disco con un centro cóncavo en la parte superior y convexo en la inferior que le confiere gran flexibilidad lo que facilita su pasaje por los vasos sanguíneos.

Los leucocitos son los elementos celulares y en general tienen funciones inmunológicas mientras que los trombocitos son fragmentos citoplasmáticos irregulares que tienen participación fundamental en la hemostasia (mantener la sangre en el torrente sanguíneo frente a una lesión).
El plasma sanguíneo está constituido aproximadamente en un 90% de agua, un 3% de sustancias disueltas y un 7% de proteínas (5).Dentro de las proteínas se encuentran las albúminas, globulinas, lipoproteínas y el fibrinógeno. En el caso de la muestra problema que es el suero humano se hace presente lo mismo que lo antes mencionado a excepción del aquellos componentes involucrados en la coagulación (como el fibrinógeno). En las sustancias disueltas se distinguen: hormonas, enzimas, urea, aminoácidos, iones en solución acuosa (como Na+, K+), carbonatos y bicarbonatos.
Pero la estrella de nuestro objetivo es el catión hierro (III) que se hace presente en el suero humano bajo esta forma y unido a su vez a una proteína la transferrina. La principal razón de que se haga presente de esta forma y no libre es que es sumamente reactivo, además de no ser soluble en el pH sanguíneo.
El hierro es un metal de transición que se caracteriza por tener un peso atómico de 55,847 u.m.a y que además posee todos sus orbitales d completos. Esta característica le permite donar o aceptar fácilmente un electrón por lo que en nuestro organismo puede encontrarse bajo su forma reducida Fe2+ o su forma oxidada Fe3+ lo que le confiere un gran potencial de reducción-oxidación. La forma reducida del hierro puede provocar la formación de radicales libres de oxígeno mediante la reacción de Fenton (3).
La absorción del hierro es sumamente importante ya que no tiene un mecanismo de eliminación directa. Este mecanismo se controla a nivel del intestino delgado, obteniéndose este elemento de los alimentos ingeridos. Se estima que en total hay en el cuerpo humano unos 65-75 mmol. de hierro, en su mayoría incorporado a proteínas y el restante 0,1% circulando en el plasma unido a la transferrina, teniendo éste como destino final en un 85% la médula ósea para la formación posterior de hemoglobina. (1)
El hierro se absorbe como Fe3+ para lo cual debe reducirse al Fe2+ favorecen esta reducción el pH ácido gástrico, los aminoácidos en el presentes, y también el ascorbato principal agente reductor natural. Si hay necesidad de hierro entonces este se une a la transferrina mediante un proceso en el cual están involucradas proteínas como la hefaestina que oxida el hierro, la ferroportina I, el receptor de la transferrina y la proteína de hematocromatosis humana que es la encargada de regular la captación de hierro por parte de la transferrina.
El transporte del hierro por el plasma tiene como principal protagonista a la transferrina. Es una proteína que cuenta aproximadamente con 679 aminoácidos y un peso molecular de entre 75-80 KDa. y un 6% de hidratos de carbono. Su estructura es una cadena larga con dos lóbulos homólogos que presentan gran afinidad por el ion férrico, teniendo en dicho extremo para la unión óptima del mismo un anión (carbonato ácido). Esta proteína se sintetiza y metaboliza en el hígado en función de la necesidad de hierro que presente el organismo, contando con una vida media de aproximadamente 7 a 10 días.
Esta proteína tiene la importante función de llevar el hierro hacia los tejidos que lo necesiten, siendo fundamental en los tejidos eritrocitopoyéticos que sintetizan hemoglobina, cuya función como ya hemos visto es de gran importancia para el cuerpo humano. Es por ello que al cuantificar el hierro sérico podemos tener un panorama general de cómo está funcionando el metabolismo de hierro y que posibles consecuencias puede tener ese funcionamiento si es que no es el adecuado.

Adultos hombres de 80 a 180 μg/dL
Adultas mujeres de 60 a 160 μg/dL
Niños menores de 1 año de 100 a 250 μg/dL
Niños de 50 a 120 μg/dL

Los valores normales de hierro sérico se adjuntan en la tabla 1-A. (5) Cualquier alteración en dichos valores puede estar asociada a variadas enfermedades relacionadas tanto con el déficit como con el exceso de hierro. Dentro de las más comunes podemos reconocer las diferentes anemias y la hemocromatosis. (1)
La hemocromatosis se produce por un incremento del hierro en los tejidos y órganos. El más afectado es el hígado que en varias oportunidades desarrolla cirrosis, mientras que en el páncreas dicha acumulación ocasiona diabetes. Se puede manifestar esta enfermedad en un bronceado que adquiere la piel. En otros casos también se han originado cardiopatías, hipogonadismo (poca o casi nula producción de hormonas por parte de las gónadas) y artralgias (emparentadas con la artritis y artrosis).
Relacionada con esta enfermedad está la hemosiderosis que se produce también por un excesivo almacenamiento de hierro en los tejidos pero que es producto de repetidas transfusiones sanguíneas.
La hemocromatosis puede clasificarse como una patología hereditaria o familiar y secundaria o adquirida. La principal causa de la primera es la mutación de una proteína, mientras que las causas de la segunda son más variadas. Pueden ocasionar en forma adquirida esta enfermedad una anemia hemolítica, excesivo aporte de hierro y alguna otra enfermedad crónica hepática (como la hepatitis C y el alcoholismo).
Básicamente lo que sucede cuando se produce esta enfermedad es que aumenta desmedidamente la concentración de hierro lo que ocasiona una saturación de la transferrina que va acompañado de un aumento en la ferritina (proteína que almacena el hierro y se hace también presente en el hígado). Generalmente la cuantización del hierro sérico sirve para evidenciar una patología de este estilo pudiendo estar acompañado a dicho análisis otro que permita verificar la saturación de la transferrina.

Por otra parte la deficiencia de hierro puede ser resultado de: la deficiencia nutricional o de la alteración funcional del metabolismo del hierro.
La primera puede darse por un faltante de dicho metal en los alimentos de ingesta diaria, una mal absorción intestinal (como es en el caso de los celíacos), una abundante pérdida de sangre (hemorragias) y por necesitarse mayor cantidad que la habitual (ej. embarazo o lactancia.)
En el segundo caso hay valores normales de hierro pero se ha alterado alguno de los componentes encargados transportar y utilizar el hierro, como ser el caso de la médula ósea. Esta situación se produce por ejemplo en las inflamaciones crónicas y la intoxicación con plomo. Este caso es ligeramente más grave que el anterior ya que no se soluciona con suplemento de hierro en la alimentación.
La anemia ferropénica es la más común a nivel mundial ya que alrededor de 800 millones de personas la poseen encontrándose comúnmente en mujeres, recién nacidos, niños y ancianos. La deficiencia del hierro consta de tres etapas. (1)
La disminución del hierro sérico provoca una disminución marcada de la expresión de la ferritina, de esta forma disminuye considerablemente la concentración de la misma en suero.
Lo que sucede por el déficit de hierro es que se produce un aumento en la síntesis de transferrina por parte del hígado. La transferrina circulante transportara mucho menos hierro produciéndose una disminución de la saturación de este. La mayor demanda de hierro de los tejidos hace que la transferrina se libere a la sangre. El aumento de su concentración en sangre es reflejo de las necesidades de los tejidos como es el caso del eritrocitopoyéticos.
La síntesis de hemoglobina es la etapa final del metabolismo de hierro, por lo que el descenso de hemoglobina en sangre es uno de los más claros indicadores de anemia los eritrocitos serán microcíticos y hipocrómicos. Este tipo de alteraciones son las finales por lo que no sirven para realizar un diagnóstico precoz de la enfermedad. (1)
Los síntomas más comunes de la anemia son la debilidad muscular, fatiga y taquicardia. En casos más severos se puede afectar también el sistema inmunológico.
Fundamento teórico
A la hora de elegir un método analítico para cumplir con el objetivo es imprescindible tener presente no solo la reactividad de nuestro analito sino también la matriz a la cual viene asociado. En el apartado anterior se trató brevemente algunas de esas características. Al pensar en hierro no es extraño tener en cuenta el EDTA (ácido etilendiaminotetracetico) aunque dada la matriz en la cual se encuentra nuestro analito y la cantidad muy pequeña en la que se hace presente, al querer titularlo, con seguridad se cometa un error enorme de titulación que conducirá con certeza a un valor erróneo y de poca utilidad tanto desde el punto de vista analítico como clínico.
A nivel de laboratorio para la cuantización del hierro sérico se utilizan técnicas espectrofotométricas no solo por su alta sensibilidad sino también por su fácil automatización. Generalmente los métodos utilizados cuentan con los mismos procedimientos generales. Primero se libera el hierro de la proteína que lo transporta (la transferrina) y se reduce de su forma Fe3+ a Fe2+, una vez que se logra esto el hierro libre en su forma reducida se hace reaccionar con reactivos como la Ferrocina o la Batofenantrolina, para dar por último como resultado un producto que se cuantifica espectrofotométricamente.
El primer problema a resolver es como separar el catión férrico de la transferrina, el cual está muy fuertemente unido a la misma. Esta proteína, portadora del hierro tiene dos puntos de enlace (estequiometria 2:1) con el metal que pueden simbolizarse como a y b. Las reacciones de microequilibrio se pueden establecer entonces como indica la Figura 1-B.









Constantes de formación efectivas en el plasma sanguíneo a pH 7,4
K1a = 6.0 x 1022 K2a = 2.4 x 1022
K1b= 1.0 x 1022 K2b = 4.2 x 1021
K1 = 7,0 X 1022 K2 = 3.6 x 1021
Para tener una idea de la magnitud de la fuerza con la que está unido el hierro a la proteína podemos explicitar los valores de las correspondientes constantes de cada equilibrio, las cuales como se puede apreciar en la Tabla 2-B son extremadamente altas por lo que será necesario utilizar un reactivo que haga perder esta afinidad por el hierro de la transferrina. (2)
Esto se logra fundamentalmente mediante la utilización de agentes reductores. En nuestro caso vamos a utilizar el ácido ascórbico (vitamina C) producto de que es de fácil obtención y barato. Este reactivo además es el que se utiliza en el sistema digestivo para reducir al hierro facilitando su absorción intestinal. Al realizar este proceso se impide de una forma efectiva que el hierro vuelva a unirse con la transferrina ya que esta no tiene receptores que para el hierro reducido.
Una vez que se reduce el hierro el siguiente problema a tratar es el de las proteínas que en medio acido pueden perder su estructura cuaternaria y formar coloides que pueden funcionar como interferentes a la hora de desarrollar una técnica espectrofotométrica, produciendo un efecto de turbidez en la muestra afectando la lectura del instrumento.
Para impedir que estas intervengan negativamente se adicionará a la muestra ácido tricloroacético un ácido orgánico fuerte que precipita a las proteínas no solo por el medio ácido que genera sino también porque los cloruros presentes en la estructura por un efecto inductivo aumentan la reactividad del carbono del grupo aldehído haciéndolo más reactivo, provocando los iones formados en solución acuosa que se produzcan alteraciones en sitios polares de las proteínas haciendo que estas interaccionen consigo mismas produciendo la precipitación por la exposición de partes hidrofóbicas al medio. Por último centrifugamos obtenemos el sobrenadante.

Es necesario que la desnaturalización sea completa producto de que las proteínas si bien no absorben en luz visible pueden llegar a formar un coloide lo cual sería un gran problema ya que al colocar nuestra muestra en el espectrofotómetro se produciría lo que se conoce como el efecto de Tyndall que se da cuando pequeñas partículas reflejan la luz, afectándose considerablemente la lectura de dicho instrumento.
Una vez que tenemos el precipitado formado quitamos el sobrenadante que contiene a nuestro analito de interés y esa va a ser la muestra problema.
Una vez obtenida la muestra problema se le adicionará un reactivo que sea capaz de acomplejar el catión hierro (II), la o-fenantrolina cuya estequiometria implica que por cada ión de hierro presente se unen tres moléculas de o-fenantrolina, tal como se muestra en la Figura 4-B. Es un complejo de color rojizo. (12) La muestra posteriormente al colocarse en el espectrofotómetro se medirá su absorbancia en un pico de aproximadamente 500 a 520 nm., longitud de onda a la cual absorbe en mayor proporción el analito de interés, aumentando así la sensibilidad del método (aumentándose por lo tanto la menor concentración que podamos registrar).
Algo a considerar es el medio en el cual se hará todo lo antes explicitado ya que hasta ahora el medio ha sido ácido por los reactivos utilizados. No obstante esto puede traernos problemas de solubilidad sobre todo con la o-fenantrolina cuya solubilidad es mucho mejor en un medio básico por lo que es conveniente usar un buffer amoniacal que no solo nos da un medio básico sino también es un muy buen agente acomplejante de metales que podrían precipitar en medio ácido como hidróxidos metálicos.
Tampoco contamos con un agente enmascarante para el Cu2+ presente en nuestra muestra y dado su tamaño (similar al del Fe2+) es muy posible que este también forme complejos con la o-fenantrolina con estequiometria similar y con una absorción semejante en la longitud de onda para el hierro. Para eso sería necesario un agente enmascarante, comúnmente se utiliza la neocuproína o tiourea. (6) Por lo que será imprescindible tener en cuenta esto a la hora de analizar los resultados.
Como en todo método espectrofotométrico es fundamental establecer el blanco. Teóricamente el blanco ideal se define como todo aquello que se hace presente en nuestra muestra excepto el analito de interés. La realidad indica que no siempre es posible obtener dicho blanco.
El más adecuado para esta práctica será aquel que no posea hierro. Para eso, se realizará el mismo procedimiento que antes de describió solo que inicialmente en lugar de agregar ácido ascórbico se adicionara primero el ácido tricloroacético y al precipitar las proteínas con ellas también lo hará el hierro en su forma de Fe2+. Una vez obtenido el sobrenadante se le agregará el ácido ascórbico y todos los reactivos que se hacen presentes durante el proceso. De este modo al medir la absorbancia del mismo se obtendrá la de todo lo que esté presente en la muestra y absorba a la misma longitud de onda que nuestro analito.
Posteriormente algo fundamental a la hora de querer determinar la concentración de una analito mediante espectrofotometría es realizar un espectro de absorción (Abs vs. Longitud de onda) para poder determinar así a que longitud de onda se da la mayor absorbancia de nuestra muestra aumentándose la sensibilidad del método. Por lo que las posteriores lecturas se harán en dicha longitud de onda por parte del espectrofotómetro.
Por otra parte uno de los principales problemas a afrontar a la hora de realizar la cuantización del analito es que como ya se vio en el apartado anterior se presenta en muy baja concentración. Para eso es conveniente utilizar a la hora de realizar la curva de calibración una adición a la muestra de hierro, en nuestro caso vamos a adicionarle sal de Mohr también conocida como Fe (NH4)2(SO4)2.6H2O.
Este método que se utilizará es conocido como adición de patrón o estándar el cual consiste básicamente en agregar a la muestra una concentración conocida de analito (en este caso hierro) y mediante el aumento en la señal obtenida se deduce cual era la concentración inicial de nuestro analito. Este método además requiere una respuesta lineal frente a ese agregado de analito. (2)
Generalmente se recurre a este método en casos como este cuando la muestra es compleja y posee en la matriz muchos elementos que pueden interferir. Se conoce como efecto matriz al cambio que experimenta una señal analítica por la presencia de todo lo que hay en la matriz. Al agregar la cantidad de analito conocida lo que se produce es una saturación del medio asegurándose que la lectura efectuada por el espectrofotómetro sea la apropiada para la cuantización del mismo. (12)
Para realizar la curva de calibración se tomaran 5 muestras de suero y se le adicionará sal de Mohr en concentración conocida, a cada muestra una concentración diferente. Midiéndose la absorbancia de cada muestra se llegara a confeccionar una curva de calibración de absorbancia en función de la concentración patrón obteniendo la relación lineal que guardan nuestras variables mediante una aproximación por mínimos cuadrados que se corresponde con la conocida ley de Beer ( A= ε. B.[]).
La ley de Beer es aplicable en este caso producto de que las concentraciones con las cuales trabajamos se encuentran dentro del rango en el que funciona la misma ([] ≤0.01M) y además la especie que queremos cuantificar no participa de un equilibrio químico.
La curva a confeccionar será la absorbancia registrada por cada una de las muestras diluidas en función de la concentración de la sal de Mohr que fue agregada a cada una. Posteriormente mediante un ajuste por mínimos cuadrados se obtendrán los parámetros de la recta que mejor se ajusta a la relación lineal que se espera tengan los puntos. Obteniéndose que la pendiente de la gráfica se corresponde con el producto entre la absortividad molar (ξ) y el camino óptico (b). Mientras que el valor de la intersección de la gráfica con el eje de las ordenadas se corresponde al múltiplo de lo anterior (ξ.b) por la concentración de hierro sérico presente en nuestra muestra.
Otras variantes que pueden observarse en este método son por ejemplo en los reactivos que pueden utilizarse para cumplir con las necesidades que se presentan para efectuar el análisis. Por ejemplo como reductores pueden utilizarse en lugar de ácido ascórbico: hidroxicloruro dehidroxilamina y el ácido tioglicólico.
También se utiliza comúnmente la ferrocina formándose en esta oportunidad un complejo púrpura midiéndose el pico de absorbancia en aproximadamente 560nm (2). Otra variante en el método está en la elección del blanco y que en el mismo podría encontrarse el analito y no el agente cromógeno. También podría solo colocarse los reactivos que se van a agregar a la muestra en un volumen similar al de esta.
Por otra parte de acuerdo con algunos métodos se mantiene un medio ácido para impedir la precipitación de sales de hierro por lo que en lugar de agregar un buffer amoniacal a la disolución podría agregarse un buffer acético/acetato en solución acuosa.
Otros métodos empleados a nivel de laboratorio para la cuantificación del hierro sérico están relacionados con propiedades de las proteínas que lo transportan. Normalmente solo un tercio de los sitios de unión de la transferrina están ocupados por Fe3+, estando los dos tercios restantes insaturados, siendo equivalentes estos a la capacidad latente de transporte de hierro. Esto es lo que comúnmente se conoce como UIBC (serumunsaturatediron-bindingcapacity).
Por otra parte a la cantidad total de sitios disponibles para la unión de hierro se le denomina TIBC (total iron-bindingcapacity).
Para determinar la TIBC, se agrega a la muestra de suero un exceso de hierro a un pH de 8,3 favoreciéndose de ese modo la saturación de la transferrina, ocupándose todos los lugares disponibles para el hierro.


A partir de esto podemos proceder de dos maneras diferentes:
El exceso de hierro es retirado por precipitación con MgCO3 o MgCl2, mientras que el hierro unido a las proteínas, que corresponde al TIBC se determina por técnica espectrofotométrica que ya se ha mencionado. La capacidad latente de fijación hierro se puede calcular como:
UIBC = TIBC – [srm – Fe]
Se determina el exceso de hierro en la solución de modo que el hierro unido a la transferrina no reaccione. La TIBC se calcula:
UIBC = Fe2+añadido – Fe2+en exceso
TIBC = UIBC + [srm – Fe]
Algo que se deriva de estos cálculos es la saturación de hierro, que se corresponde con la relación entre la concentración de hierro y la TIBC multiplicado por 100.
Saturación de hierro (%) =
La concentración de hierro desciende en los pacientes con anemia ferropénica y también los que tiene anemia secundaria y enfermedades inflamatorias crónicas. Niveles elevados de hierro se detectan en pacientes con hemocromatosis o hepatitis aguda. (1)







Materiales y reactivos
• MicropipetaJencons 50-200
• MicropipetaSealpette
• Probeta 25mL SimaxKavalierStabil
• Vaso de Bohemia 80 mL Schott Duran.
• Matraz aforado 100mL ± 0,16 Poliglass
• Pipeta aforada 2mL ± 0,006 Vitrex
• Centrífuga Routine modelo RMM-44
• Agitador magnético de placa caliente Jenway serie 1000
• Espectrofotómetro simple haz.
• Espectrofotómetro doble haz. UV-1800

• Cloruro de amonio Biopackppa
• Fenantrolina Merck ppa
• Ácido Ascórbico Anedrappa
• Ácido Tricloroacético.
• Sal de Mohr.












Protocolo experimental
A la hora de ejecutar este protocolo se tuvo en cuenta que cualquier muestra es potencialmente peligrosa, más aun siendo en este caso una muestra humana.
Se anexaran al final del trabajo una breve reseña de los reactivos utilizados (es también muy conveniente tener conocimiento de ellas).
Todo instrumento que se utilizó para la ejecución del protocolo se lavó meticulosamente con agua de calidad Mili Q de alta resistividad (18,2 MΩ), ya que cualquier ión presente podría alterar el resultado.
1. Se tomaron tubos de ensayo. Se colocaron los reactivos en cada uno tal como se indica en la tabla.
Reactivo Blanco Muestra
Sal de Mohr - 100 µL
H2O (mQ 18,2 MΩ) 2500 µL 2400µL
O- Fenantrolina 0,2% 500 µL 500 µL

Se dejó reposar aproximadamente por 10 minutos y se procedió a realizar un espectro de absorbancia (Generalmente existen espectrofotómetros como el UV-1800 de doble haz que hacen la gráfica).S Registrar el valor máximo de absorbancia obtenido. Que se utilizará para recoger las posteriores absorbancias.
2. Tomar otros dos tubos de ensayos o viales y colocar en cada uno los reactivos como se indica en la tabla.
Reactivo Blanco Muestra Problema
Suero 500 μL 1000 μL
H2O 1000 μL 2000 μL
Ácido Ascórbico (0,495 M) - 1500 μL
Ácido Tricloroacético (14,28%) 750 μL 1500 μL
Nota: al agregar en el blanco ácido tricloroacético se visualizó un precipitado correspondiente a las proteínas presentes en el suero.

3. Luego se centrifugó el blanco por 10 minutos a una velocidad de aproximadamente 3000 Rpm (es imprescindible tener en cuenta el peso de los viales ya que se colocaron en la centrifugadora a modo de que su peso quede equilibrado). Se tomó el sobrenadante con una pipeta monocanal y se agregaron 750 µL de ácido ascórbico para que la composición química del blanco sea igual que la de la muestra. Posteriormente a otro vial 800 μL del sobrenadante colocándose en dicho vial y 1700 μL de agua y 500 µL de O-Fenantrolina. Siendo este último el blanco a utilizarse.

4. Para confeccionar la curva de calibración se tomaron 5 tubos. Colocándose los reactivoscomo indica la siguiente tabla.
Tubo Sobrenadante Sal de Fe2+ H2O O-fenantrolina
1 800 μL 20 μL 1680 μL 500 μL
2 800 μL 40 μL 1660 μL 500 μL
3 800 μL 60 μL 1640 μL 500 μL
4 800 μL 80 μL 1620 μL 500 μL
5 800 μL 100 μL 1600 μL 500 μL
Se dejó reposar aproximadamente 5 minutos y luego se procedió a medir la absorbancia a la longitud de onda obtenida en el pico del espectro de absorbancia antes realizado. Desde la más diluida a la más concentrada.
Nota:Se utilizó una única celda para evitar en gran medida las desviaciones instrumentales en la ley de Beer.
5. Se graficó la absorbancia registrada por el espectrofotómetro para cada tubo de ensayo, en función de la concentración de la sal de hierro.
6. Se obtuvo por mínimos cuadrados la recta que mejor ajuste linealmente los valores obtenidos. Ya que esperamos una relación lineal entre ambas variables para que se cumpla la ley de Beer.
7. Al hacer la gráfica se obtuvieron los parámetros correspondientes a la pendiente de la gráfica y a la intersección de la misma con el eje de las ordenadas. (Con sus correspondientes errores).
8. Se calculó a partir de los parámetros obtenidos la concentración de hierro sérico, teniendo en cuenta el factor de dilución.

Resultados
Inicialmente se obtuvo el espectro de absorbancia referido al analito de interés. Obteniéndose el siguiente gráfico.Observándose un máximo en la absorbancia a los 511,7 nm

Por otra parte se procedió a preparar la muestra para su centrifugado. En las imágenes que se muestran a continuación se puede observar una secuencia en la cual se forma el precipitado blanco que se corresponde a las proteínas presentes en el suero correspondientes al punto dos del protocolo como resultado de agregar al Eppendorff de la muestra, ácido tricloroacético.

Lo mismo se hizo para el blanco en el que solo se agregó suero, agua mili Q y el ácido tricloroacético ya que se esperaba que el hierro precipitara completamente con las proteínas.
Una vez centrifugados ambos Eppendorfs se obtuvieron los correspondientes sobrenadantes observándose, particularmente en el caso del precipitado del blanco un color verde claro, evidencia fundamental de la presencia de catión hierro (III).

En la imagen de la izquierda se puede observar claramente un precipitado blanco que se corresponde con las proteínas presentes en el suero de la muestra. Por otra parte en la imagen de la derecha se pueden observar ambos Ependorffs siendo uno el mismo que se encuentra en la foto de la izquierda y a su lado el que contiene el sobrenadante correspondiente al blanco, en el cual se puede observar un precipitado de color verde pálido que se corresponde al catión hierro (III) y de menor magnitud producto de que por falta de suero tuvimos que reducir a la mitad todos los volúmenes relacionados con el mismo.
Posteriormente se realizó el punto cuatro del protocolo, procediéndose a realizar las diluciones. Como se muestra en la imagen de la derecha. Observándose un color naranja que se corresponde con el complejo de hierro II con la O-Fenantrolina.
Una vez formadas las diluciones tal como se indicó en el protocolo se procedió a dejar reposar unos 10 minutos las diluciones. Posteriormente Se obtuvieron las absorbancias correspondientes.

[Sal de Mohr] (µg/mL) Absorbancia corregida
1,466667 0,265
2,933 0,478
4,4 0,772
5,867 1,039
7,3 1,184

Al realizar el grafico correspondiente y realizar un ajuste lineal por mínimos cuadrados:

Se obtuvieron de la gráfica los siguientes parámetros a raíz del ajuste:
Parámetro Valor Error
b (intercept) 0,02545 0,00931
m (pendiente) 0,16437 0,04522

A partir de los datos antes obtenidos y de suponer que no se cometieron errores importantes en la preparación de las diluciones (algo que es completamente falso por que se arrastraron errores a la hora de disponer cada volumen para cada dilución).Se obtuvo inicialmente que la concentración de hierro sérico sin considerar los factores de dilución es de aproximadamente:
[Fe2+ sérico] = 0,153691765µg/mL
Con un error porcentual correspondiente a un 36,68 %. Obteniéndose un intervalo de:
[Fe2+ sérico] = (0,154± 0,071) µg/mL
Ahora considerando todos los factores de dilución correspondientes obtenemos que
[Fe2+ sérico] muestra= 287,5672059
Con un error porcentual asociado de la misma magnitud obteniéndose un intervalo de:
[Fe2+ sérico]muestra= (2,9 ± 1,3) x 102µg/dL
[Fe2+ sérico] min. = 160µg/dL
[Fe2+ sérico] máx.= 420µg/dL

Por otra parte al graficar los datos obtenidos por otro grupo en el mismo horario y que realizó exactamente el mismo protocolo. Datos que se indican a continuación.

[Sal de Mohr] (µg/mL) Absorbancia corregida Absorbancia corregida
1,466667 0,265 0,216
2,933 0,478 0,482
4,4 0,772 0,758
5,867 1,039 0,992
7,3 1,184 1,292



Se obtuvo el correspondiente gráfico de Absorbancia en función de la concentración de sal de Mohr.

Se obtuvieron por mínimos cuadrados los siguientes parámetros
Parámetro Valor error
b (intercept) - 0,01135 0,02649092
m (pendiente) 0,172253409 0,0054459
Como la pendiente es negativa se obtuvo como único resultado de esta gráfica que
b máx. = 0,015140924
Con este valor se calculó la concentración de hierro máxima = 0,08775613 µg/mL
Ahora considerándose los factores de dilución correspondiente se obtiene:
[Fe2+ sérico] máx.= 164,5427442µg/dL
No se calculó el error de la medida ya que se usó el mayor b posible de acuerdo con el error de dicho parámetro.
Por ultimo un resultado interesante que se desprende de la experiencia es el de la absortibidad molar (que producto de que el camino óptico es 1 cm) que se corresponde con la pendiente de la gráfica, siendo en nuestro caso de 0,16437 μg-1.cm-1.mL.


Discusión
Para empezar es considerable tener en cuenta que a la hora de confeccionar la curva de calibración pequeños cambios producidos en la pendiente (que son resultadoentre otras cosas, de pequeños errores en las diluciones) provocan grandes diferencias en el valor de b ocasionándose grandes errores en el valor del parámetro, el cual a su vez nos da el valor de la concentración de nuestro analito de interés.
Al analizar la gráfica obtenida solo con nuestros datos podemos observar que el intervalo más probable en donde puede encontrarse la concentración real de nuestro analito está por encima de los valores normales, encontrándose la concentración mínima por debajo de los valores máximos en un adulto. Por lo que podríamos descartar en un principio una deficiencia de hierro en la persona de la cual se extrajo la muestra.
Igualmente dado el gran número de errores que se cometieron y no fueron considerados por ejemplo los errores en las diluciones al poner cada volumen, no es un resultado del todo confiable.
Por otra parte al analizar la gráfica obtenida agregando a nuestros datos los de otro grupo, se obtuvo que la concentración máxima de hierro estaba dentro del intervalo delimitado por los valores normales. Pero al no poder encontrar el valor mínimo posible, por ser negativa la pendiente, no podemos afirmar con certeza ningún intervalo en el cual sea más probable encontrar el valor de la concentración de nuestro analito. Igualmente no sería tan incoherente pensar dado los datos obtenidos antes, (en la primera curva) que la persona de la cual se extrajo la muestra tiene valores de la concentración de hierro sérico dentro de los valores normales, o que al menos no presenta un déficit de hierro. Se consideró apropiada la unión de los datos de ambos grupos producto de que vemos que se confunden y claramente tienen una relación muy similar, aunque fueron realizados por diferentes personas cometiéndose por cada uno diferentes errores sistemáticos.
Conclusión
Dados los resultados obtenidos y considerando todo lo expuesto en la discusión, podemos concluir que la concentración de hierro sérico de la muestra está muy próxima a los valores normales, pudiéndose descartar de ambas curvas que el adulto del cual se extrajo la muestra tenga un déficit de hierro.


Anexo
Breve reseña de las fichas de seguridad de los reactivos:
Ácido Tricloroacético:
• Ácido tricloroetanoico
• TCA
• C2HCl3O2 / CCl3COOH
• Masa molecular: 163.4 g.mol-1
• Aspecto: Cristales incoloros e higroscópicos, de olor acre.
No combustible. En caso de incendio se desprenden gases y vapores irritantes y tóxicos. Por inhalación puede provocar tos, sensación de quemazón dolor de cabeza, náuseas vómitos y Jadeo. Dificultad respiratoria. Síntomas no inmediatos. A nivel cutáneo se produce enrojecimiento, ampollas y quemaduras cutáneas. A nivel ocular se pueden presentar graves quemaduras. En caso de ingestión pueden provocarse fuertes dolores abdominales y en casos extremos shock con posterior desvanecimiento. NO provocar el vómito.
En caso de derrame: barrer la sustancia derramada e introducirla en un recipiente llenos de agua; si fuera necesario, humedecer el polvo para evitar su dispersión. Neutralizar cuidadosamente el residuo con bases como bicarbonato de sodio e hidróxido de sodio. Eliminarlo a continuación con agua abundante.
O- Fenantrolina:
• 1,10-Fenantrolina1-hidrato
• Fórmula: C12H8N2.H2O
• Masa molecular: 198,23 g.mol-1
• Aspecto: sólido blanco e incoloro.
Tóxico en caso de ingestión. En caso de pérdida de conocimiento no dar de beber ni provocar el vómito. No se conocen efectos irritantes o sensibilizantes. Es sumamente nocivo para peces. Su eliminación nunca debe ser por el alcantarillado.


Ácido ascórbico:
• Acido 3-oxo-L-gulofuranolactona (forma enólica), Acido L-xiloascórbico, Vitamina C.
• Fórmula : C6H8 O6
• Peso Molecular: 176,1 g.mol-1
• Aspecto: sólido de color blanco de olor característico.
Por inhalación puede producir tos, en contacto con los ojos puede producir enrojecimiento, por ingestión de grandes cantidades puede producir vómitos y diarrea. Producto combustible, las partículas finamente dispersas formanmezclas explosivas con el aire.
En solución provoca un medio levemente ácido y reacciona con bases fuertes.
Cloruro de Amonio:
• Sal amónica, Sal de Amonio, Sal de Amoníaco, Muriato de Amonio.
• Fórmula: NH4Cl
• Peso Molecular: 53.5 g.mol-1
• Aspecto: Cristales incoloros o blancos, de aspecto granular, inodoros e higroscópicos (absorben humedad del aire).
Por inhalación se produce irritación de la nariz, garganta y pulmones. Dolor de garganta y tos. Por ingestión se produce irritación en la nariz y garganta. En grandes dosis causa nauseas, vómito y acidosis. A nivel cutáneo da Irritación y enrojecimiento. A nivel de los ojos causa irritación, enrojecimiento y dolor. El contacto con la solución puede causar serios daños. No hay datos sobre efectos crónicos.
Sal de Mohr:
• Ferroso amonio sulfato hexahidratado.
• Fórmula: (NH4)2Fe(SO4)2.6H2O
• Peso Molecular: 392,13 g.mol-1
• Aspecto: Sólido verde.
Incombustible. En caso de incendio pueden formarse vaporestóxicos. No permitir el paso del agua de extinción a acuíferos superficiales o subterráneos. Sustancia calificada como no peligrosa en caso de ingerir no provocar el vómito ni dar de beber.
Referencias
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